Кристаллическая структура пневмолизина при разрешении 2,0 Å выявляет молекулярную упаковку пре

Научные отчеты, том 5, Номер статьи: 13293 (2015) Цитировать эту статью

16 тысяч доступов

45 цитат

73 Альтметрика

Подробности о метриках

Пневмолизин представляет собой холестерин-зависимый цитолизин (CDC) и фактор вирулентности Streptococcus pneumoniae. Он убивает клетки, образуя поры, собранные из олигомерных колец в холестеринсодержащих мембранах. Крио-ЭМ выявила структуры связанных с поверхностью мембраны олигомеров препор и вставленных пор, однако молекулярные контакты, которые опосредуют эти олигомеры, неизвестны, поскольку информация с высоким разрешением недоступна. Здесь мы определили кристаллическую структуру полноразмерного пневмолизина с разрешением 1,98 Å. В структуре кристаллические контакты демонстрируют вероятные взаимодействия, которые обеспечивают полимеризацию на клеточной мембране и молекулярную упаковку предпорового комплекса. Гемолитическая активность прекращается у мутантов, которые нарушают эти межмолекулярные контакты, что подчеркивает их важность во время образования пор. Одна лишь дополнительная кристаллическая структура мембраносвязывающего домена предполагает, что изменения в конформации триптофановой петли в основании токсина способствуют взаимодействиям мономер-мономер при связывании с мембраной путем создания новых контактов. Примечательно, что остатки на границе раздела консервативны у других членов семейства CDC, что указывает на общий механизм сборки пор и предпор.

Холестерозависимый цитолизин (CDC), пневмолизин1, является фактором вирулентности человеческого патогена Streptococcus pneumoniae (пневмококк)2, основной причиной бактериальной пневмонии и основным возбудителем менингита и септицемии, а также изнурительных заболеваний, таких как средний отит, септический артрит, кератит и синусит3. Он обнаруживается практически во всех изолятах пневмококка и играет ключевую роль в бактериальной колонизации, инвазии и воспалении4,5,6. Центральной особенностью токсина является образование трансмембранных пор в холестеринсодержащих мембранах7, которые лизуют или нарушают функционирование клеток в зависимости от концентрации8,9,10. Пневмолизин и другие CDC связываются с мембранами млекопитающих через петлю, богатую триптофаном, и пару треонин-лейцин внутри мембраносвязывающего домена в основании токсина11,12. Было высказано предположение, что петля, богатая триптофаном, выходит из тела токсина при соединении с мембраной12. Все три триптофана участвуют в мембранном связывании, но Trp433 и Trp435 особенно важны13,14. После связывания с мембраной мономеры затем олигомеризуются с образованием комплекса препор, который впоследствии претерпевает сложный набор структурных переходов с образованием трансмембранной поры, обычно состоящей из 30–50 субъединиц. Структуры олигомеров предпор и вставленных пор были определены с помощью крио-ЭМ при ~ 28 Å, и эти структуры вместе с недавним анализом родственного CDC, суилизина, показывают, что образование пор следует за вертикальным коллапсом предпоры. структура с двумя удлиненными бета-шпильками, пронизывающими мембрану и образующими большую бета-бочкообразную пору7,15.

Хотя рентгеновские структуры высокого разрешения были определены для нескольких CDC, пневмолизин оказался неуловимым. Следовательно, структурно-функциональный анализ основывался на моделях, основанных на структурах других токсинов CDC. Крайне важно, что отсутствие данных высокого разрешения означает, что взаимодействия, позволяющие мономерам пневмолизина упаковываться вместе с образованием комплексов пор и предпор, неизвестны. В данной работе мы определили структуру пневмолизина с разрешением 1,98 Å. Расположение упаковки «бок о бок» в кристалле демонстрирует упаковку мономеров в предпоровом комплексе. Дополнительные данные по структурированию и мутагенезу выявили остатки, которые, вероятно, способствуют олигомеризации во время образования предпор.

Полноразмерный пневмолизин и усеченная форма, содержащая мембраносвязывающий домен (домен 4), были получены экспрессией в E.coli и очищены с помощью аффинной и гель-фильтрационной хроматографии. Кристаллы полноразмерного токсина выращивали при 4 °С и рН 8,5. Лучшие кристаллы были получены из белка, содержащего замены Asp385Asn и Cys432Ala. Ни одна из мутаций не предотвращает образование пор16,17. Асимметричная единица содержала одну молекулу, имеющую характерную четырехдоменную структуру CDC с тремя несмежными доменами (домены 1–3), связанными с С-концевым мембраносвязывающим доменом (рис. 1А) через ленточный домен. 2. Кристалл мембраносвязывающего домена был выращен при комнатной температуре и содержал две молекулы в асимметричном звене. Обе уточненные модели имеют хорошую стереохимию (таблица 1) с 95% и 93% остатков в регионах, предпочитаемых Рамачандраном.

3000-fold-fold decrease of hemolytic activity (Table 2). Both residues are located towards in the middle of the binding interface within domain 1 (Fig. 5A). Other mutations in domain 1 also lead to large decreases in activity, including Thr88Glu, Arg147E and Arg226Ala and to a lesser extent Ser68Glu and Asn86Arg. The mutation Thr304Arg within domain 3, also resulted in a large decrease in activity (300-fold). In the structure, the threonine side chain forms part of a β strand that packs against the hydrocarbon portion of the side chain of Lys268. This strand may displaced upon oligomerisation on the membrane to allow the monomers to pack together to form the ring. Only three mutations had relatively little effect on haemolysis (≤2-fold): Leu11Arg, Asp338Ala and V341Arg. Interestingly, all three residues are located in the posterior region of domain 1, which forms the outer part of the pre-pore ring, towards the perimeter of the binding interface. The clustering of these residues suggests that this region of the toxin may be less important for oligomerization, perhaps reflect some flexibility./p>