Характеристика метаболизма инозитол-липидов в кишечнике

Природная микробиология, том 7, страницы 986–1000 (2022 г.) Процитировать эту статью

7354 Доступа

7 цитат

122 Альтметрика

Подробности о метриках

Липиды инозитола широко распространены у эукариот и играют тонко настроенную роль в клеточной передаче сигналов и мембранном гомеостазе. Однако у бактерий продукция инозитол-липидов встречается относительно редко. Недавно сообщалось, что известная кишечная бактерия человека Bacteroides thetaiotaomicron (BT) продуцирует инозитол-липиды и сфинголипиды, но пути этого процесса остаются неоднозначными, а их распространенность неясной. Здесь, используя геномные и биохимические подходы, мы исследовали кластер генов синтеза инозитол-липидов в БТ, используя ранее неописанный штамм с индуцируемым контролем синтеза сфинголипидов. Мы охарактеризовали путь биосинтеза от синтеза мио-инозитол-фосфата (MIP) до фосфоинозитолдигидроцерамида, определили кристаллическую структуру рекомбинантного фермента BT MIP-синтазы и идентифицировали фосфатазу, ответственную за превращение фосфатидилинозитолфосфата бактериального происхождения (PIP-DAG) в фосфатидилинозитол (ПИ-ДАГ). In vitro потеря продукции инозитол-липидов изменила экспрессию капсул BT и устойчивость к противомикробным пептидам. In vivo потеря инозитоловых липидов снизила приспособленность бактерий на модели гнотобиотических мышей. Мы идентифицировали второй предполагаемый, ранее неописанный путь бактериального синтеза PI-DAG без промежуточного продукта PIP-DAG, распространенный у Prevotella. Наши результаты показывают, что продукция инозитол-сфинголипидов широко распространена у Bacteroidetes, ассоциированных с хозяином, и имеет значение для симбиоза.

Инозитол, карбоциклический сахар, распространенный у эукариот, образует основу для разнообразных фосфорилированных вторичных мессенджеров инозитолфосфатов и инозитоллипидов. В простейшем случае инозитол-липиды имеют инозитол в качестве полярной головной группы, например, фосфатидилинозитол (PI-DAG; глицерофосфолипидный каркас; рис. 1а) или инозитолфосфорилцерамид (сфинголипидный каркас). Головная группа инозитола может быть дополнительно модифицирована, включая фосфорилирование PI-DAG с образованием биоактивных фосфоинозитидов или добавление маннозы к инозитолсфинголипидам с образованием манносилинозитолфосфорилцерамидов, распространенных в дрожжах1,2. Производные инозитола контролируют ключевые процессы физиологии эукариотических клеток. Например, хотя фосфоинозитиды составляют небольшую часть общих фосфолипидов, они необходимы для маркировки идентичности органелл, регуляции взаимодействий цитоскелета и мембраны и контроля клеточного деления и аутофагии3,4.

a, Метаболический путь синтеза сфинголипидов de novo в связи с синтезом инозитол-липидов, с ферментами BT, исследованными в этом исследовании (жирный черный), и репрезентативными липидными структурами, с длиной цепи и разветвлением, отражающими преобладающие структуры, определенные с помощью анализа метиловых эфиров жирных кислот (см. Информация, дополнительные рисунки 1 и 2 и таблица 6). Паттерны ветвления липидов на основе дигидроцерамидов предсказаны, но не подтверждены. Сфинголипидные структуры обозначены фиолетовым цветом и показаны на голубом фоне; глицерофосфолипидные структуры обозначены зеленым цветом на сером фоне. Липиды инозитола обведены пунктирной линией. SPT – серинпальмитоилтрансфераза. б — Геномная область синтеза инозита BT и инозитол-липидов с хромосомной нумерацией (показана в обратной ориентации). Цвет гена (синий или красный) указывает на принадлежность к оперону, предсказанному BioCyc. Аннотации представляют функции фермента, выявленные в этом исследовании (из-за отсутствия липидного фенотипа у его нокаутного штамма BT_1524 остается гипотетическим). Субстраты и продукты сфинголипидной части а не перечислены, поскольку эти реакции (помимо SPT) не были охарактеризованы у Bacteroidetes.

Несмотря на широкое распространение инозитол-липидов у эукариот, мало что известно о структуре и распределении инозитол-липидов у бактерий. Бактериальные инозитол-липиды встречаются сравнительно редко, и ранее считалось, что они ограничиваются в основном синтезом PI-DAG у актинобактерий (например, Mycobacteria, Corynebacteria и Streptomyces)5,6,7 и спирохет (Treponema)8. У Mycobacterium Tuberculosis, облигатного внутриклеточного патогена, инозитоловые головные группы PI-DAG связывают поверхностные олигосахаридные факторы вирулентности с внешней мембраной9.

1.5 and exclude those with maximum absolute log2-fold-change difference in expression <1.5 in all pairwise comparisons of conditions. The tree above the expression data represents the Euclidean column clustering defining the sample order by expression similarity. Colour in the far right column indicates gene assignment to one of 8 CPS loci. Strains tested include WT BT, iSPT, ΔBT_1522 and iSPTΔBT_1526 in the iSPT background. SPT induction in the iSPT strains at 0, 0.2, 1.0, 5.0 or 100 ng ml−1 aTC induction is indicated in shades of grey. Labels below each column indicate strain, induction level and replicate ID according to the following pattern: ‘(strain) - (aTC induction in ng ml−1) (replicate A/B)’. Blue and pink shading emphasizes replicates from the ΔBT_1526 and ΔBT_1522 strains, respectively. b, Percent abundance of inositol among total glycosyl residues detected in each WT and inositol lipid knockout strain (n = 3 biological replicates per strain tested; means ± s.d.). Legend and data colours are the same as in c and d. Full capsule analysis (lipids and glycosyl residues) are available in Extended Data Fig. 6. c, IC50 (n = 2 biological replicates per strain) for each WT and BT inositol lipid knockout strain in minimal medium supplemented with the cationic antimicrobial peptide LL-37. Data are representative of two experiments and represented as mean ± s.d. One-way ANOVA F(5,6) = 35.5; P = 0.0002; Tukey’s multiple comparisons: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001. WT vs ΔBT_1523 P = 0.0124; WT vs ΔBT_1525 P = 0.0007; WT vs ΔBT_1526 P = 0.0016. d, Caecal BT colonization of mice after 14 d bacterial association. Copies of BT (c.f.u.-equivalents quantified by qPCR analysis of BT_1521 copy number) present in mouse caecal contents after 14 d strain association. One-way ANOVA F(3,28) = 5.6; P = 0.004; Tukey’s multiple comparisons: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01 (n = 8 mice; each point is the mean of 3 technical replicate measurements). WT vs ΔBT_1526 P = 0.0496; ΔBT_1522 vs ΔBT_1523 P = 0.0480; ΔBT_1523 vs ΔBT_1526 P = 0.0050. Normality of data distribution was confirmed using the D’Agostino-Pearson test at alpha = 0.05. e, Percent abundances of WT in the combined WT + ΔBT_1523 population in the initial inoculum (n = 1, mean of 3 technical replicates) and in the caeca of 8 gnotobiotic mice following a 14 d colonization (n = 8 mice; each point is the mean of 3 technical replicates per mouse). The black line indicates the median of the WT BT abundance in mouse caeca following the competition experiment (73.0%)./p>100 glycosyl residues can be bound to a single lipid-linked inositol44,45. However, the low inositol abundance in our capsule analysis lacks enough statistical power to determine this unequivocally in BT. The CPS loci expressed by BT, and differentially expressed when MIPS is deficient, have been shown to influence recognition by the host adaptive immune system and bacteriophage29,46. The strong effect of MIPS deficiency on transcription of capsule-related genes may therefore indicate an indirect role for inositol on cross-kingdom interactions./p>20 mg l−1 of E. coli culture./p>1.5./p> 0.05. In the RNA-seq experiment, P values were calculated from empirical Bayes moderated t-statistics and adjusted according to the Benjamini-Hochberg method; only significantly differentially expressed genes with >1.5 absolute log2 fold change are reported. The ‘n’ reported in each experiment represents an individual biological replicate for the relevant experiment (for example, mouse caecal sample, bacterial culture). No statistical methods were used to pre-determine sample sizes, but our sample sizes are similar to those reported in previous publications51. Data collection and analysis were not performed blind to the conditions of the experiments. No animals or data were excluded from the analyses. In mouse experiments, mice were randomly assigned to a treatment condition to randomize age and litter of origin. For in vitro experiments, following strain generation, identical treatments were performed (for example, lipid extraction and analysis, capsule extraction and analysis, AMP resistance and growth curves) so randomized allocation was not necessary. TLC experiments were repeated independently at least two times with similar results./p>